18º Semana

Hoy realizamos la corrida electroforetica con los productos de amplificacion de la semana anterior. Se observa al UV la presencia de perfiles de RAPD cuya comparacion permitira el estudio de la posible fuente de infeccion.

16º Semana

Nos encontramos con que el protocolo del RAPD anterior no nos dio resultados positivos. Provamos el RAPD con un protocolo nuevo, usando el primer 1253. Las concentracion por tubo fue:
-Agua: 21 microL
-Buffer: 2,5 microL
-Cloruro de Magnesio: 0,5 microL
-dNTPs: 0,5 microL
-Primer: 0,05 microL
-Taq DNA Pol.: 0,1 microL
-ADN: 0,5 microL

15º Semana

Con el protocolo descripto para cryptococo neoformans no hubo amplificación positiva, con lo cual se decidió probar otro primer at-random (Primer 1281), descripto para la amplificación, de cándia alvicans. Dada la escasa literatura que aporte alguna información para la genotipicación de las cándidas guillermondi que estamos estudiando.
Hoy probamos realizar amplificación at-random con otro protocolo para cándidas guillermondi:
Las proporciones fueron (para cada tubo):
-Agua: 41,65 microL
-Buffer: 5 microL
-Cloruro de Magnesio: 1 microL
-dNTPs: 1 microL
-Primer: 0,1 microL
-Taq DNA Pol.: 0,25 microL
-ADN: 1 microL

Las muestras fueron amplificadas en el termociclador bajo los siguientes ciclos:
Completar:
1- 95ºC 120 segundos (Pre-heating)
2- 95ºC 40 segundos (desnaturalización)
3- 50ºC 40 segundos (annealing)
4- 72ºC 59 segundos (extensión)
5- 72ºC 5 minutos (extensión final)

30 ciclos 2, 3 y 4.

14º Semana

Preparamos Buffer TBE 5X: 1,75 gramos de ácido bórico, 27 gramos de TriBase y 10 ml de solución de EDTA 0,5 M, pH=8. Llevamos a 500 microL con agua y autoclavamos.
Preparamos el gel de agarosa (50 ml, 0,8%) para realizar una electroforesis con los productos del RAPD.
Luego de disolver, y llegado a temperatura ambiente se le agregó 4 microL de Bromuro de etidio, y se lo dejó solidificar en un soporte con el peine incluído.
A cada uno de los 9 tubos se le agregó 5 microL de loading Buffer.
Se sembraron los 9 tubos en sus respectivas calles, y se comenzó la corrida electroforética a 100 Volt.
Observamos la corrida con luz ultravioleta.

13º Semana

Preparación de los materiales necesarios para la realización de un RAPD. Se preparó una mix con: los siguientes compuestos:
160 microL de Agua, 27 microL de Buffer, Cloruro de Magnesio, 4,5 microL de dNTPs, 27 microL de Primer, 1,8 microL de Taq DNA Pol. Se repartó la mix en 9 tubos (8 muestras y un control negativo). Luego se las colocó en el termociclador para la realización de la RAPD con el siguiente protocolo:
1- 95ºC 120 segundos (Pre-heating)
2- 95ºC 40 segundos (desnaturalización)
3- 50ºC 40 segundos (annealing)
4- 72ºC 59 segundos (extensión)
5- 72ºC 5 minutos (extensión final)
30 ciclos 2, 3 y 4.

Se observó al ultravioleta la corrida con las extracciones, luego de que las muestras fueron tratadas con RNAsa.

12º Semana

Finalizamos la técnica de extracción de ADN.
Centrifugamos las muestras, agregamos 0,5 ml de alcohol 70% para lavar el alcohol puro. Centrifugamos nuevamente, descartamos el sobrenadante y agregamos buffer TE a las muestras de ADN.
Preparamos un gel de Agarosa con bromuro de etidio, lo dejamos solidificar. Luego procedimos a sembrar las muestras (10 micro litros de ADN y 4 de loading), colocamos el gel en la cuba cubierta con buffer TBE 1X (previamente preparado), y comenzamos la corrida electroforética para verificar la calidad y cantidad de ADN extraído.
Visualizamos con luz ultra violeta y los resultados obtenidos fueron:
Muestra 1: banda tenue.
Muestra 2: banda gruesa.
Muestra 3: banda tenue.
Muestra 4: no se observa banda.

Se agregó 10 microlitros de RNAsa a cada muestra para purificarla y sacar todo el RNA. Se observa abundante RNA en las tres primeras muestras.

11º Semana

Preparamos una solución de Fenol-cloroformo-Isoamílico (25:24:1). Se lo agregó a las diferentes muestras (cuatro) para la extracción del DNA. Se centrifugó a 13000 rpm durante 5 minutos.
Se transfirió la fase acuosa superior a un tubo con 50 micro litros de Acetato de Sodio 3 M.
Luego le agregamos 1 ml de Etanol puro frío para precipitar el DNA. Lo mezclamos por inversión varias veces, y vimos como se formaba el rulo de DNA.
Lo dejamos en el freezer durante 24 horas para que precipite todo el DNA presente.