14º Semana

Preparamos Buffer TBE 5X: 1,75 gramos de ácido bórico, 27 gramos de TriBase y 10 ml de solución de EDTA 0,5 M, pH=8. Llevamos a 500 microL con agua y autoclavamos.
Preparamos el gel de agarosa (50 ml, 0,8%) para realizar una electroforesis con los productos del RAPD.
Luego de disolver, y llegado a temperatura ambiente se le agregó 4 microL de Bromuro de etidio, y se lo dejó solidificar en un soporte con el peine incluído.
A cada uno de los 9 tubos se le agregó 5 microL de loading Buffer.
Se sembraron los 9 tubos en sus respectivas calles, y se comenzó la corrida electroforética a 100 Volt.
Observamos la corrida con luz ultravioleta.

13º Semana

Preparación de los materiales necesarios para la realización de un RAPD. Se preparó una mix con: los siguientes compuestos:
160 microL de Agua, 27 microL de Buffer, Cloruro de Magnesio, 4,5 microL de dNTPs, 27 microL de Primer, 1,8 microL de Taq DNA Pol. Se repartó la mix en 9 tubos (8 muestras y un control negativo). Luego se las colocó en el termociclador para la realización de la RAPD con el siguiente protocolo:
1- 95ºC 120 segundos (Pre-heating)
2- 95ºC 40 segundos (desnaturalización)
3- 50ºC 40 segundos (annealing)
4- 72ºC 59 segundos (extensión)
5- 72ºC 5 minutos (extensión final)
30 ciclos 2, 3 y 4.

Se observó al ultravioleta la corrida con las extracciones, luego de que las muestras fueron tratadas con RNAsa.

12º Semana

Finalizamos la técnica de extracción de ADN.
Centrifugamos las muestras, agregamos 0,5 ml de alcohol 70% para lavar el alcohol puro. Centrifugamos nuevamente, descartamos el sobrenadante y agregamos buffer TE a las muestras de ADN.
Preparamos un gel de Agarosa con bromuro de etidio, lo dejamos solidificar. Luego procedimos a sembrar las muestras (10 micro litros de ADN y 4 de loading), colocamos el gel en la cuba cubierta con buffer TBE 1X (previamente preparado), y comenzamos la corrida electroforética para verificar la calidad y cantidad de ADN extraído.
Visualizamos con luz ultra violeta y los resultados obtenidos fueron:
Muestra 1: banda tenue.
Muestra 2: banda gruesa.
Muestra 3: banda tenue.
Muestra 4: no se observa banda.

Se agregó 10 microlitros de RNAsa a cada muestra para purificarla y sacar todo el RNA. Se observa abundante RNA en las tres primeras muestras.

11º Semana

Preparamos una solución de Fenol-cloroformo-Isoamílico (25:24:1). Se lo agregó a las diferentes muestras (cuatro) para la extracción del DNA. Se centrifugó a 13000 rpm durante 5 minutos.
Se transfirió la fase acuosa superior a un tubo con 50 micro litros de Acetato de Sodio 3 M.
Luego le agregamos 1 ml de Etanol puro frío para precipitar el DNA. Lo mezclamos por inversión varias veces, y vimos como se formaba el rulo de DNA.
Lo dejamos en el freezer durante 24 horas para que precipite todo el DNA presente.

10º Semana

Continuamos con la técnica de extracción de levaduras.
A cada una de las cuatro muestras se les agregó 0,5 ml de una solución de lisis que contenía por cada 100 ml:
-20 ml de NaCl 1 M
-20 ml de EDTA 0,5 M
-5 ml de Tris ClH 1 M (pH=8,5)
-55 ml de Agua destilada.
Luego agragamos 5 microlitros de SDS al 10%, 10 microlitros de una solcuión de Proteinasa K (2000 microgramos/ml), y lo dejamos incubar durante una hora, a 65ºC.

9º Semana

Continuamos con la técnica de extracción de ADN, prosiguiendo con la preparación de esferoplastos.
Se lavó la muestra con Sorbitol, se lo centrifugó 10 minutos a 3000 rpm, se descartó el sobrenadante, y a cada muestra se le agregó 1 ml de solución para formación de esferoplastos.
Luego lo dejamos incubando a 37ºC por 4 horas.

8º Semana

El primer que se utilizó para la PCR no se unió a ninguna secuencia génica por lo que hay que seguir con la investigación para saber qué primer es útil para la diferenciación genética de las cepas.
Sembramos en agar YPD para comenzar la extracción de ADN.
Repicamos las cepas para mantenerlas frescas.