10º Semana

Continuamos con la técnica de extracción de levaduras.
A cada una de las cuatro muestras se les agregó 0,5 ml de una solución de lisis que contenía por cada 100 ml:
-20 ml de NaCl 1 M
-20 ml de EDTA 0,5 M
-5 ml de Tris ClH 1 M (pH=8,5)
-55 ml de Agua destilada.
Luego agragamos 5 microlitros de SDS al 10%, 10 microlitros de una solcuión de Proteinasa K (2000 microgramos/ml), y lo dejamos incubar durante una hora, a 65ºC.

9º Semana

Continuamos con la técnica de extracción de ADN, prosiguiendo con la preparación de esferoplastos.
Se lavó la muestra con Sorbitol, se lo centrifugó 10 minutos a 3000 rpm, se descartó el sobrenadante, y a cada muestra se le agregó 1 ml de solución para formación de esferoplastos.
Luego lo dejamos incubando a 37ºC por 4 horas.

8º Semana

El primer que se utilizó para la PCR no se unió a ninguna secuencia génica por lo que hay que seguir con la investigación para saber qué primer es útil para la diferenciación genética de las cepas.
Sembramos en agar YPD para comenzar la extracción de ADN.
Repicamos las cepas para mantenerlas frescas.

7º Semana

Se volvieron a repicar las cepas no crecidas de la semana pasada para su conservación, sin embargo el noventa porciento de las cepas repicadas tuvieron un crecimiento exitoso ya que fue puro y abundante.
Se realizó una PCR utilizando ADN de hongos levaduriformes previamente extraidos. Se amplificaron 4 cepas con el Primer 1281 (at-random) descripto para estos hongos. Se realizó por duplicado con 2 Taq para probar la sensibilidad de las mismas (Taq y GoTaq).
El protocolo de amplificación para la utilización del PCR es el que se detalla a continuación:
1: 94ºC (5 minutos)
2: 94ºC (30 segundos)
3: 36ºC (30 segundos)
4: 72ºC (1 minuto)
5: 36 ciclos
6: 72ºC (10 minutos)

6º Semana

Repicamos cepas de hongos para su correcta conservación.
Nos familiarizamos con el protocolo de PCR y definimos las estrategias a seguir para la semana que viene. Realizamos los cálculos para saber cuánto reactivo hay que poner de cada DNA en estudio.
Protocolo:
http://www.promega.com/paguide/chap1.htm#title6
Observamos la electroforesis realizada la semana pasada con luz ultravioleta, tuvo resultados satisfactorios demostrando que la extracción fue realizada como es debido.
Breve clase teórica de PCR.

5º Semana

Observamos las muestras sembradas la semana anterior.
Hoy preparamos una muestra buffer a partir de TBE 5X y lo diluimos a 1X. Luego pesamos 0.4g de agarosa y lo llevamos a 50ml con el buffer antes preparado para hacer una corrida electroforética. Lo calentamos hasta que se disolvió toda la agarosa. Lo dejamos enfriar a 37ºC aproximadamente, lo colocamos en la bandeja, pusimos los peines, dejándolo solidificar.
Luego sembramos muestras de ADN de hongos levaduriformes extraidos de pacientes (hemocultivos y nutricion parenteral) en los pocillos del gel de agarosa para empezar la electroforesis y observar. Esto fue realizado para poder apreciar las bandas, y de esa forma verificar si la extraccion del ADN fue correcta.

4º Semana

Repicamos cepas en chromagar para la identificación de levaduras.
Búsqueda y observación de estructuras fúngicas en materiales clínicos (escamas).

Observación:
No pudimos terminar con el plan del día debido a una evacuación del edificio por causa de una alarma de incendio.