18º Semana

Hoy realizamos la corrida electroforetica con los productos de amplificacion de la semana anterior. Se observa al UV la presencia de perfiles de RAPD cuya comparacion permitira el estudio de la posible fuente de infeccion.

16º Semana

Nos encontramos con que el protocolo del RAPD anterior no nos dio resultados positivos. Provamos el RAPD con un protocolo nuevo, usando el primer 1253. Las concentracion por tubo fue:
-Agua: 21 microL
-Buffer: 2,5 microL
-Cloruro de Magnesio: 0,5 microL
-dNTPs: 0,5 microL
-Primer: 0,05 microL
-Taq DNA Pol.: 0,1 microL
-ADN: 0,5 microL

15º Semana

Con el protocolo descripto para cryptococo neoformans no hubo amplificación positiva, con lo cual se decidió probar otro primer at-random (Primer 1281), descripto para la amplificación, de cándia alvicans. Dada la escasa literatura que aporte alguna información para la genotipicación de las cándidas guillermondi que estamos estudiando.
Hoy probamos realizar amplificación at-random con otro protocolo para cándidas guillermondi:
Las proporciones fueron (para cada tubo):
-Agua: 41,65 microL
-Buffer: 5 microL
-Cloruro de Magnesio: 1 microL
-dNTPs: 1 microL
-Primer: 0,1 microL
-Taq DNA Pol.: 0,25 microL
-ADN: 1 microL

Las muestras fueron amplificadas en el termociclador bajo los siguientes ciclos:
Completar:
1- 95ºC 120 segundos (Pre-heating)
2- 95ºC 40 segundos (desnaturalización)
3- 50ºC 40 segundos (annealing)
4- 72ºC 59 segundos (extensión)
5- 72ºC 5 minutos (extensión final)

30 ciclos 2, 3 y 4.

14º Semana

Preparamos Buffer TBE 5X: 1,75 gramos de ácido bórico, 27 gramos de TriBase y 10 ml de solución de EDTA 0,5 M, pH=8. Llevamos a 500 microL con agua y autoclavamos.
Preparamos el gel de agarosa (50 ml, 0,8%) para realizar una electroforesis con los productos del RAPD.
Luego de disolver, y llegado a temperatura ambiente se le agregó 4 microL de Bromuro de etidio, y se lo dejó solidificar en un soporte con el peine incluído.
A cada uno de los 9 tubos se le agregó 5 microL de loading Buffer.
Se sembraron los 9 tubos en sus respectivas calles, y se comenzó la corrida electroforética a 100 Volt.
Observamos la corrida con luz ultravioleta.

13º Semana

Preparación de los materiales necesarios para la realización de un RAPD. Se preparó una mix con: los siguientes compuestos:
160 microL de Agua, 27 microL de Buffer, Cloruro de Magnesio, 4,5 microL de dNTPs, 27 microL de Primer, 1,8 microL de Taq DNA Pol. Se repartó la mix en 9 tubos (8 muestras y un control negativo). Luego se las colocó en el termociclador para la realización de la RAPD con el siguiente protocolo:
1- 95ºC 120 segundos (Pre-heating)
2- 95ºC 40 segundos (desnaturalización)
3- 50ºC 40 segundos (annealing)
4- 72ºC 59 segundos (extensión)
5- 72ºC 5 minutos (extensión final)
30 ciclos 2, 3 y 4.

Se observó al ultravioleta la corrida con las extracciones, luego de que las muestras fueron tratadas con RNAsa.

12º Semana

Finalizamos la técnica de extracción de ADN.
Centrifugamos las muestras, agregamos 0,5 ml de alcohol 70% para lavar el alcohol puro. Centrifugamos nuevamente, descartamos el sobrenadante y agregamos buffer TE a las muestras de ADN.
Preparamos un gel de Agarosa con bromuro de etidio, lo dejamos solidificar. Luego procedimos a sembrar las muestras (10 micro litros de ADN y 4 de loading), colocamos el gel en la cuba cubierta con buffer TBE 1X (previamente preparado), y comenzamos la corrida electroforética para verificar la calidad y cantidad de ADN extraído.
Visualizamos con luz ultra violeta y los resultados obtenidos fueron:
Muestra 1: banda tenue.
Muestra 2: banda gruesa.
Muestra 3: banda tenue.
Muestra 4: no se observa banda.

Se agregó 10 microlitros de RNAsa a cada muestra para purificarla y sacar todo el RNA. Se observa abundante RNA en las tres primeras muestras.

11º Semana

Preparamos una solución de Fenol-cloroformo-Isoamílico (25:24:1). Se lo agregó a las diferentes muestras (cuatro) para la extracción del DNA. Se centrifugó a 13000 rpm durante 5 minutos.
Se transfirió la fase acuosa superior a un tubo con 50 micro litros de Acetato de Sodio 3 M.
Luego le agregamos 1 ml de Etanol puro frío para precipitar el DNA. Lo mezclamos por inversión varias veces, y vimos como se formaba el rulo de DNA.
Lo dejamos en el freezer durante 24 horas para que precipite todo el DNA presente.

10º Semana

Continuamos con la técnica de extracción de levaduras.
A cada una de las cuatro muestras se les agregó 0,5 ml de una solución de lisis que contenía por cada 100 ml:
-20 ml de NaCl 1 M
-20 ml de EDTA 0,5 M
-5 ml de Tris ClH 1 M (pH=8,5)
-55 ml de Agua destilada.
Luego agragamos 5 microlitros de SDS al 10%, 10 microlitros de una solcuión de Proteinasa K (2000 microgramos/ml), y lo dejamos incubar durante una hora, a 65ºC.

9º Semana

Continuamos con la técnica de extracción de ADN, prosiguiendo con la preparación de esferoplastos.
Se lavó la muestra con Sorbitol, se lo centrifugó 10 minutos a 3000 rpm, se descartó el sobrenadante, y a cada muestra se le agregó 1 ml de solución para formación de esferoplastos.
Luego lo dejamos incubando a 37ºC por 4 horas.

8º Semana

El primer que se utilizó para la PCR no se unió a ninguna secuencia génica por lo que hay que seguir con la investigación para saber qué primer es útil para la diferenciación genética de las cepas.
Sembramos en agar YPD para comenzar la extracción de ADN.
Repicamos las cepas para mantenerlas frescas.

7º Semana

Se volvieron a repicar las cepas no crecidas de la semana pasada para su conservación, sin embargo el noventa porciento de las cepas repicadas tuvieron un crecimiento exitoso ya que fue puro y abundante.
Se realizó una PCR utilizando ADN de hongos levaduriformes previamente extraidos. Se amplificaron 4 cepas con el Primer 1281 (at-random) descripto para estos hongos. Se realizó por duplicado con 2 Taq para probar la sensibilidad de las mismas (Taq y GoTaq).
El protocolo de amplificación para la utilización del PCR es el que se detalla a continuación:
1: 94ºC (5 minutos)
2: 94ºC (30 segundos)
3: 36ºC (30 segundos)
4: 72ºC (1 minuto)
5: 36 ciclos
6: 72ºC (10 minutos)

6º Semana

Repicamos cepas de hongos para su correcta conservación.
Nos familiarizamos con el protocolo de PCR y definimos las estrategias a seguir para la semana que viene. Realizamos los cálculos para saber cuánto reactivo hay que poner de cada DNA en estudio.
Protocolo:
http://www.promega.com/paguide/chap1.htm#title6
Observamos la electroforesis realizada la semana pasada con luz ultravioleta, tuvo resultados satisfactorios demostrando que la extracción fue realizada como es debido.
Breve clase teórica de PCR.

5º Semana

Observamos las muestras sembradas la semana anterior.
Hoy preparamos una muestra buffer a partir de TBE 5X y lo diluimos a 1X. Luego pesamos 0.4g de agarosa y lo llevamos a 50ml con el buffer antes preparado para hacer una corrida electroforética. Lo calentamos hasta que se disolvió toda la agarosa. Lo dejamos enfriar a 37ºC aproximadamente, lo colocamos en la bandeja, pusimos los peines, dejándolo solidificar.
Luego sembramos muestras de ADN de hongos levaduriformes extraidos de pacientes (hemocultivos y nutricion parenteral) en los pocillos del gel de agarosa para empezar la electroforesis y observar. Esto fue realizado para poder apreciar las bandas, y de esa forma verificar si la extraccion del ADN fue correcta.

4º Semana

Repicamos cepas en chromagar para la identificación de levaduras.
Búsqueda y observación de estructuras fúngicas en materiales clínicos (escamas).

Observación:
No pudimos terminar con el plan del día debido a una evacuación del edificio por causa de una alarma de incendio.

3º Semana

Hoy repicamos muestras de infecciones fúngicas de pacientes, debido a que los medios estaban casi agotados y secos. Se repicaron en medio de agar Sabouroud para la correcta conservación de las mismas. Despues los pusimos a incubar en la estufa.
Luego nos tomamos una muestra de exudado de fauces (ver video). Se sembró la muestra tomada en un medio de agar Sabouroud para observar su crecimiento.
A partir de unas escamas extraidas de pacientes tomamos una muestra, las digerimos con hidróxido de potasio al 40% y las observamos al microscopio para averiguar si tenían una infección fúngica (ver video).
Tomamos fotos a lo largo de la jornada para mostrar la infraestructura del lugar.

Fotos del establecimiento donde trabajamos:




Procedimiento para saber si una enfermedad proviene de los hongos:



Exudado de fauces:

2º Semana

Repaso Introducción Fúngica.
Clase teórica sobre Micopatología y Epidemiología. Concepto de PCR y RAPD.
Redactamos un resumen con los conceptos aprendidos hasta el momento.
Sembramos dos muestras de distintos tipos de hongos en dos medios de cultivo diferentes, para la semana que viene poder apreciar su crecimiento.
También aplicamos el método de la tinta china para poder observar al hongo Levaduriforme con su cápsula.

1º Semana

Reconocimiento del lugar.
Presentacion del proyecto.
Introduccion global a la biologia fungica.
Disociamos una muestra de hongos en un portaobjetos para poder visualizarla en el microscopio.
Vimos diferentes tipos de estructuras de hongos.